在分子生物學(xué)的研究當(dāng)中,分子與分子之間的互作關(guān)系是極其重要的課題,而在這其中,蛋白質(zhì)與 RNA 分子的互作則是為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控創(chuàng)造了豐富的可能性。 

RIP-seq,全稱 RNA Immunoprecipitation Sequencing,該技術(shù)從一種已知的蛋白質(zhì)出發(fā),使用針對該蛋白的特異性抗體將目標(biāo)蛋白以及與其結(jié)合的 RNA 復(fù)合物沉淀下來, 進(jìn)而對富集到的 RNA 進(jìn)行分離和建庫測序,從而揭示 蛋白質(zhì)-RNA 之間的結(jié)合關(guān)系。 

RIP-seq 擁有廣泛的應(yīng)用場景,例如:通過針對 AGO2 蛋白的 RIP-seq,可以獲取參與 RNA 干擾以及 miRNA 海綿機(jī)制的相關(guān) RNA 的信息;通過針對特定 RNA 修飾酶的 RIP-seq,可以知曉該 RNA 修飾酶的靶位點(diǎn);通過針對特定 RBP(RNA 結(jié)合蛋白)的 RIP-seq,可以獲知 RBP 結(jié)合并調(diào)控的靶基因…… 由于其在分子機(jī)制研究上的出色表現(xiàn),RIP-seq 已經(jīng)成為高分論文的利器。 

RIP 實(shí)驗(yàn)的成敗是決定測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵因素。云序生物經(jīng)過多年的經(jīng)驗(yàn)積累,自研開發(fā)了商業(yè)化的 Genseq RIP 試劑盒,為 RIP 實(shí)驗(yàn)的成功率和穩(wěn)定性保駕護(hù)航。云序生物實(shí)驗(yàn)室也承接 RIP-seq 以及 RIP-qPCR 業(yè)務(wù),提供從樣品處理,文庫制備,上機(jī)測序到數(shù)據(jù)分析的一站式技術(shù)服務(wù),助力復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院、中科院上海植物生理生態(tài)研究所、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院在內(nèi)的諸多研究機(jī)構(gòu)的客戶發(fā)表了十余篇 RIP-seq 論文,其中不乏登上 Nature 子刊、Cell 子刊的高水平研究。

以下幾篇精彩案例不容錯過:

案例 1 

論文標(biāo)題:Hypoxia regulates overall mRNA homeostasis by inducing Met1-linked linear ubiquitination of AGO2 in cancer cells

發(fā)表期刊:Nature Communications (IF=17.694)

作者單位:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院

樣品類型:人類 HeLa 細(xì)胞系

詳細(xì)解讀:RIP-seq項(xiàng)目文章|nature子刊揭示低氧誘導(dǎo)AGO2線性泛素化調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制 

miRNA 對 mRNA 的表達(dá)沉默作用需要 AGO2 蛋白的介導(dǎo)。在常氧和缺氧兩種環(huán)境下,作者針對 AGO2 蛋白進(jìn)行了 RIP-seq 實(shí)驗(yàn),揭示了缺氧處理對 AGO2 結(jié)合的 mRNA 的影響。累積分?jǐn)?shù)分析顯示,缺氧顯著降低了 mRNA 與 AGO2 的相互作用。通過包括 miRNA 測序在內(nèi)的一系列后續(xù)實(shí)驗(yàn),作者發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo) AGO2 與 HOIP 以及 HOIL-1L 等的相互作用,它們與 miRNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(miRISC)共定位,進(jìn)而催化 AGO2 蛋白發(fā)生 Met1 殘基連接的泛素化(AGO2 M1-Ubi )。通過 RIP-seq 結(jié)果與 mRNA-seq  結(jié)果的比較,作者證實(shí) AGO2 M1-Ubi 機(jī)制可以降低本應(yīng)受 miRNA 調(diào)控的靶 mRNA 與 AGO2 的結(jié)合,從而造成 mRNA 的積累。 

案例 2

論文標(biāo)題:Translational Regulation of Plant Response to High Temperature by a Dual-Function tRNAHis Guanylyltransferase in Rice

發(fā)表期刊:Molecular Plant (IF=21.949)

作者單位:中科院上海植物生理生態(tài)研究所

樣品類型:水稻種子

詳細(xì)解讀:云序客戶再發(fā)高分文章,教你如何玩轉(zhuǎn)tRNA機(jī)制研究

作者通過包括  tRNA-seq  在內(nèi)的一系列實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn) tRNAHis 表達(dá)量的異常,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)一個 tRNAHis 的鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶 AET1,它有助于 pre-tRNAHis 的修飾,并且對水稻在高溫條件下的正常生長不可或缺。作者隨后針對 AET1 蛋白進(jìn)行了 RIP-seq,發(fā)現(xiàn)了 208 種 mRNA 在高溫條件下與 AET1 蛋白結(jié)合。RIP-seq 的聚類熱圖顯示植物生長素相關(guān)基因存在明顯的組間差異,其中 OsARF 基因最為明顯。作者隨后進(jìn)行了 RIP-qPCR 驗(yàn)證,確認(rèn)了高溫環(huán)境下 AET1 蛋白與 OsARF 基因的主要開放閱讀框(mORF)以及上游開放閱讀框(uORF)均存在結(jié)合。作者隨后還進(jìn)行了翻譯組水平的一些實(shí)驗(yàn),證明 AET1 通過 tRNA 影響水稻植物生長素信號相關(guān)蛋白的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)為AET1通過在tRNA修飾和翻譯控制中發(fā)揮雙重作用來調(diào)控水稻的環(huán)境溫度反應(yīng)的分子機(jī)制提供了新的見解。

 案例 3

論文標(biāo)題:SUMOylation of YTHDF2 promotes mRNA degradation and cancer progression by increasing its binding affinity with m6A-modified mRNAs

發(fā)表期刊:Nucleic Acids Research(IF= 19.16)

作者單位:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院

樣品類型:人類肺癌細(xì)胞系

詳細(xì)解讀:云序客戶余健秀課題組m6A方向再次取得重大發(fā)現(xiàn)——SUMO化促進(jìn)YTHDF2結(jié)合m6A修飾的mRNA影響癌癥進(jìn)展

RNA m6A 修飾的閱讀蛋白 YTHDF2 在體內(nèi)和體外的主要部位K571被SUMO化,它可以被缺氧誘導(dǎo),而被氧化壓力和SUMO化抑制劑減少。YTHDF2的SUMO化對其泛素化和定位的影響不大,但會大大增加其與m6A修飾的mRNA的結(jié)合親和力,隨后導(dǎo)致基因表達(dá)的失調(diào),這也是癌癥發(fā)展的原因。此外,來自TCGA數(shù)據(jù)集的肺腺癌患者的無病生存分析顯示,YTHDF2的高表達(dá)和SUMO1的高表達(dá)預(yù)示著不良的預(yù)后。此項(xiàng)研究揭示了YTHDF2識別m6A-RNAs的一個新的調(diào)節(jié)機(jī)制,并強(qiáng)調(diào)了YTHDF2的SUMO化在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)和癌癥進(jìn)展中的重要性。

案例 4

論文標(biāo)題:The RNA binding protein SORBS2 suppresses metastatic colonization of ovarian cancer by stabilizing tumorsuppressive immunomodulatory transcript

發(fā)表期刊:Genome Biology(IF= 17.906)

作者單位:四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院

樣品類型:人類卵巢癌細(xì)胞系

詳細(xì)解讀:叕一篇!云序客戶高分文章,教你如何巧用RIP測序玩轉(zhuǎn)分子機(jī)制!

本文揭示了RNA結(jié)合蛋白SORBS2在卵巢癌腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的重要生物學(xué)作用。從數(shù)據(jù)庫搜索,到通過RIP-seq鎖定SORBS2靶基因,RIP-seq 聯(lián)合全轉(zhuǎn)錄組測序的相關(guān)生物信息學(xué)分析提示SORBS2結(jié)合并穩(wěn)定部分轉(zhuǎn)錄本,其中WFDC1和IL-17D作為SORBS2結(jié)合的重要靶點(diǎn)可以抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移灶的定殖。相關(guān)結(jié)果提出了一個全新的連接癌癥發(fā)展和免疫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò),這一網(wǎng)絡(luò)依賴于SORBS2結(jié)合并穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本的重要生物學(xué)作用。

案例 5

論文標(biāo)題:Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition

發(fā)表期刊:RNA Biology (IF= 4.766)

作者單位:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院

樣品類型:雞肝臟組織

詳細(xì)解讀:云序手把手教您如何應(yīng)用RIP和RNA pull down技術(shù)——研究RNA分子互作機(jī)制沖擊高分文章

這篇文章主要研究circRNA Vav3通過吸附gga-miRNA-375促進(jìn)雞肝癌的EMT過程,也是運(yùn)用了RIP-PCR和RNA pull down-PCR實(shí)驗(yàn)探究了circRNA Vav3能夠吸附gga-miRNA-375的機(jī)制

案例 6

論文標(biāo)題:Attenuation of Piwil2 induced by hypoxic postconditioning prevents cerebral ischemic injury by inhibiting CREB2 promoter methylation

發(fā)表期刊:Brain Pathology(IF=7.611)

作者單位:廣州醫(yī)科大學(xué)

樣品類型:大鼠腦組織

詳細(xì)解讀:用戶文章,1區(qū) | 新型非編碼RNA piRNA測序揭示腦缺血神經(jīng)損傷機(jī)制

作者在本文中描述了 Piwil2在通過表觀遺傳機(jī)制調(diào)節(jié) CREB2表達(dá)和介導(dǎo)大鼠 tGCI (短暫全局性腦缺血)后 HPC (低氧后處理)的神經(jīng)保護(hù)中的作用。HPC 下調(diào)了 tGCI 后 CA1區(qū)域中 Piwil2的表達(dá),作者通過針對 Piwil2 蛋白的 RIP +  piRNA-seq  發(fā)現(xiàn)了組間差異 piRNA 共同調(diào)控的基因:DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT3A。DNMT3A 反過來消除了 tGCI 誘導(dǎo)的 CREB2啟動子甲基化的增加,從而增加了 CREB2在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平。此外,HPC 誘導(dǎo)的 Piwil2的減少起到了恢復(fù)樹突復(fù)雜性和樹突長度的作用,并阻止了 CA1區(qū)域神經(jīng)元樹突棘的喪失,從而改善了 tGCI 后大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。

RNA免疫沉淀(RIP)技術(shù)介紹

01 RIP實(shí)驗(yàn)原理

RIP技術(shù)(RNABinding Protein Immunoprecipitation,RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀),是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù),是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有力工具。運(yùn)用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來,然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析,結(jié)合的RNA可以通過定量PCR(RIP-PCR)或高通量測序(RIP-seq)方法來鑒定。

02 RIP-seq技術(shù)簡介

這種技術(shù)運(yùn)用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來,然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析。RIP-Seq將RIP技術(shù)與高通量測序相結(jié)合,能夠高通量地檢測與特定蛋白結(jié)合的RNA,從而解析全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的目標(biāo)蛋白-RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。云序生物是業(yè)內(nèi)少數(shù)的既做前端高通量測序篩選,同時實(shí)現(xiàn)一站式解決功能機(jī)制的科研服務(wù)公司。在各RNA分子研究火熱的現(xiàn)階段,更多科研工作者想要在通過高通量篩選到目的基因后,解決RNA的分子機(jī)制問題,云序提供的RIP和RNA pull down技術(shù)正好解決分子機(jī)制的核心技術(shù)難點(diǎn)。

03 RIP試劑盒

GenSeq®RNA免疫沉淀試劑盒(RIP試劑盒),應(yīng)用于RNA-蛋白質(zhì)互作研究。通過RIP方法,可以檢測與特定蛋白結(jié)合的RNA,從而為研究分子機(jī)制提供強(qiáng)勢助力。優(yōu)化過的實(shí)驗(yàn)流程后獲得的蛋白結(jié)合RNA可以廣泛應(yīng)用于后續(xù)的定量RT-PCR,高通量測序以及其他檢測分析。

 云序生物服務(wù)優(yōu)勢 

優(yōu)勢一:一站式服務(wù),客戶只需提供細(xì)胞,組織RIP后 RNA,云序生物為您完成從樣品處理,文庫制備,上機(jī)測序到數(shù)據(jù)分析整套服務(wù)流程。

優(yōu)勢二:商業(yè)化的RIP試劑盒RIP實(shí)驗(yàn)的成敗是決定數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵,云序生物采用商業(yè)化RIP試劑盒,保證了RIP實(shí)驗(yàn)的成功率和穩(wěn)定性。

優(yōu)勢三:嚴(yán)格的質(zhì)控,云序生物在實(shí)驗(yàn)的各個關(guān)鍵步驟加入了一系列質(zhì)控點(diǎn),全程監(jiān)控實(shí)驗(yàn)質(zhì)量,確�？蛻舻玫絻�(yōu)質(zhì)的數(shù)據(jù)。

優(yōu)勢四:專業(yè)化的生物信息分析,云序生物具有強(qiáng)大的生物信息學(xué)團(tuán)隊(duì),能夠滿足客戶的各類深入數(shù)據(jù)分析要求。

相關(guān)產(chǎn)品 

根據(jù)已知分子和目標(biāo)分子的不同,常見的蛋白質(zhì)-RNA 互作研究的實(shí)驗(yàn)方法有如下幾種類型:

RIP-seq

RNA-Pull Down

CO-IP

雙熒光素酶驗(yàn)證Label free蛋白質(zhì)譜TMT 蛋白質(zhì)譜

RNA-seq

mRNA-seq

miRNA-seq

mRNA-qPCR

miRNA-qPCR

RIP試劑盒

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